質粒小量提取試劑盒II型，Plasmid Mini Kit II(5)使用說明書

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名稱：質粒小量提取試劑盒II型

品牌：Omega

供應商：上海遠慕

英文名/型號：Plasmid Mini Kit II(5)

用途：從小于15ml培養過夜的菌液提取50-70ug高純度質粒DNA

Plasmid Mini Kit II(5)特性與優點：
安全－無酚lvfang等危險的有機物抽提
可靠－操作簡單，每次都能獲得理想的效果
快速－可在35分鐘內完成一次抽提工作
方便－用小型柱就可以獲得較大量的質粒DNA

質粒小量提取試劑盒II型操作流程：

1.取過夜菌1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀。通常大腸桿菌宜用LB培養過夜（16小時左右）至OD值為2-4。建議5000g（通常為5000rpm左右）室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升菌液并重復上述操作，然后倒置于吸水紙上（可用普通草紙），使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復上述操作1-2次。對于高拷貝質粒所用菌量一般不能超過5毫升，對于低拷貝質粒所用菌量一般不能超過10毫升。過量的細菌會導致后續的裂解不充分。

2.每管加入250微升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀*散開，無可見細菌團塊。確認溶液I中已經添加了RNase A。速度vortex 5-10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應呈
均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。

3.每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細菌*裂解，溶液透明。切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致*終所得質粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有*散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。

4.每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致*終所得質粒的質量下降。

5.速（13,000rpm左右）室溫離心10分鐘。離心后會產生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。

6.將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。速離心30-60秒，倒棄收集管內液體。質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。

7.在質粒純化柱內加入750微升溶液IV，速離心30-60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體。加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。

8.速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇*揮發。
注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。

9.將質粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內柱面上，放置1分鐘。溶液 V 需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V 沾在管壁上，一定要震動管子，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 級純水替代溶液 V，但是水的 pH 應不小于 6.5。溶液 V 加入后放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。

10.速離心1分鐘，所得液體即為高純度質粒。
通常所得質粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質粒，可以采用常規的乙醇沉淀方法濃縮質粒。

該試劑盒專門為提供較大量的質粒而設計，硅膠柱結合質粒能力是I型的兩倍。適合于從5-15ml培養過夜的細菌培養液中抽提高達70µg的質粒DNA，*小量抽提與中量抽提之間的空白。純化的質粒可以直接用于自動測序、限制性內切酶酶切以及PCR 、標記以及體外轉錄等實驗。

標簽：Plasmid Mini Kit II(5)   質粒小量提取試劑盒II型    質粒小量提取試劑盒