質(zhì)粒中量提取試劑盒，Plasmid Midi Kit(25)使用說明書

上海遠(yuǎn)慕生物專業(yè)供應(yīng)美國Omega旗下產(chǎn)品：DNA、RNA回收純化相關(guān)溶液，基因組DNA相關(guān)溶液，RNA相關(guān)溶液，質(zhì)粒相關(guān)溶液，酸洗玻璃珠，破壁酶Lyticase，植物組織直接PCR試劑盒，動(dòng)物組織直接PCR試劑盒，石蠟組織（FFPE）直接PCR試劑盒，磁珠mRNA組織直接抽提試劑盒，質(zhì)粒大量提取試劑盒，其他系列等，本司代理多款進(jìn)口品牌及國產(chǎn)品牌供您選擇，產(chǎn)品包含：ELISA試劑盒，動(dòng)物血清，質(zhì)粒載體，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品，培養(yǎng)基，抗體，化學(xué)試劑，生化試劑，染色液，實(shí)驗(yàn)耗材，其他實(shí)驗(yàn)試劑等，品種齊全，型號(hào)廣，價(jià)格實(shí)惠，咨詢訂購！

名稱：質(zhì)粒中量提取試劑盒

品牌：Omega

供應(yīng)商：上海遠(yuǎn)慕

英文名/型號(hào)：Plasmid Midi Kit(2)

英文名/型號(hào)：Plasmid Midi Kit(10)

英文名/型號(hào)：Plasmid Midi Kit(25)

英文名/型號(hào)：Plasmid Midi Kit(100)

用途：從15-50ml細(xì)菌培養(yǎng)液中純化200-250ug高純度的質(zhì)粒DNA

Plasmid Midi Kit(25)特性與優(yōu)點(diǎn)：
無內(nèi)毒素－內(nèi)毒素含量低于0.1EU/µg
方便－菌裂解液中去除雜質(zhì)無需離心操作
安全－無酚lvfang抽提
可靠－操作簡(jiǎn)單

Plasmid Midi Kit(25)操作步驟：

提示：將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，使用后置于2-8℃保存。

1.取過夜培養(yǎng)菌40-60ml（zui大不超過90 ml）菌液，裝入50ml離心管中，4,500~6,000 x g于4℃離心5 min沉淀菌體（也可12,000 x g離心2分鐘），*棄除上清。

2.加入2.5 ml 溶液P1，充分混懸震蕩菌體沉淀，使其*分散開，至無絮塊存在。室溫放置3~5 min。    如果有未*混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.加入2.5 ml 溶液P2，輕輕顛倒離心管6~8次，室溫放置5 min，使細(xì)菌*裂解，溶液透明。  溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦饣蚪MDNA剪切斷裂！所用時(shí)不應(yīng)超過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不*，應(yīng)減少菌體量。

4.加2.5 ml溶液PⅢ，立即顛倒離心管6~8次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml離心管中。  加入溶液PⅢ后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。  注意： 使用異丙醇沉淀，蛋白雜質(zhì)和鹽離子共沉淀較少，可能看不到明顯的較大團(tuán)塊沉淀，但是質(zhì)粒還是可以*沉淀下來，不影響實(shí)際的質(zhì)粒產(chǎn)量。如果你習(xí)慣看見較大的沉淀團(tuán)塊操作，可以選擇2倍體積的無水乙醇沉淀。

5.加入5 ml 異丙醇，顛倒離心管，充分混勻。  

6.于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min，小心棄去上清，倒置于吸水紙上輕輕瀝干殘余液體，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，zui高速離心5分鐘，棄上清，晾干沉淀。  DNA沉淀如果干燥過頭，DNA將無法*溶解，但是如果乙醇沒有晾干揮發(fā)干凈，殘留太多，也會(huì)造成DNA無法*溶解。  注意：異丙醇離心沉淀后，質(zhì)粒純度很高吸附在管底和側(cè)壁可能看不見沉淀，但是不影響產(chǎn)量，后續(xù)步驟仔細(xì)吹打管底和沉淀所在的側(cè)壁涮洗溶解質(zhì)粒。

7.加入0.7 ml 溶液P1*溶解沉淀團(tuán)塊，注意附著在管底和側(cè)壁上的質(zhì)粒沉淀雖然可能看不見，也要吹打管底和沉淀所在的側(cè)壁涮洗下來（大質(zhì)粒可用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解）。然后將質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)入1個(gè)新的1.5 ml離心管中。  可選步驟（一般不需要）：如果菌株RNA豐富有微量RNA殘留，可在此步驟后將質(zhì)粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8.加入55μl雜質(zhì)清除液A，顛倒充分混勻后加入約0.1體積(約80μl)冰預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，顛倒旋轉(zhuǎn)7-10次（30秒左右）充分混勻，冰浴或者冰上放置>=5分鐘，中間偶爾顛倒混勻幾次。  內(nèi)毒素清除劑加入上清后，上清會(huì)變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮。 注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉(zhuǎn)染，可在此步驟只加入55μl雜質(zhì)清除液A，充分混勻后冰上放置5分鐘，離心后小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新管，直接接步驟11。

9.42℃水浴，溶液又會(huì)變?yōu)闇啙幔嵉够靹蚝?2℃溫育5分鐘。  

10.室溫14,000 x g離心5 min分相（溫度低時(shí)，內(nèi)毒素清除劑無法分相，因此必須 至少20℃以上室溫離心或者保證冬季轉(zhuǎn)頭溫度20℃以上）。上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層。溶液必須分為上下兩相，否則應(yīng)重復(fù)步驟9-10。  

11.將上一步所得上層水相中加入等體積雜質(zhì)清除液B（約750μl），輕柔混勻，4℃  14,000 x g離心10 min，棄上清（注意不要丟失DNA），輕輕加入1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上清，共兩次，室溫倒置晾干5~10 min使乙醇*揮發(fā)。

12.加適量TE或者純水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。 要注意很多質(zhì)粒DNA可能附著在離心管側(cè)壁上，即使看不見，也應(yīng)該充分吹打側(cè)壁溶解回收質(zhì)粒DNA。  zui后沉淀可以根據(jù)需要選擇任意小體積溶解，這樣可以得到很高濃度的轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒DNA（高達(dá)5-10μg/μl）。如果有需要，客戶也可以選擇更大體積溶解。

溫馨提示：以上相關(guān)說明請(qǐng)以產(chǎn)品實(shí)際說明書為準(zhǔn)！

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