線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)詳細介紹

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中文名：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)

供應商：上海遠慕

規(guī)格：50T/100T

分類：細胞檢測

保存：—20℃,避光,12個月

保存說明： -20℃保存。JC-1(200X)需避光保存，并盡量避免反復凍融。超純水和JC-1染色緩沖液(5X)也可4℃保存。

用途:細胞凋亡的生物化學分析,線粒體膜電位檢測

組成：主要由JC-1染料儲存液,JC-1 buffer、CCCP等組成,可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位,采用FACS檢測。

適用范圍：限于科研，實驗，不作臨床

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)詳細介紹

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)說明

1、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) 是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。

2、通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。 

3、JC-1是一種檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；

4、在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

5、JC-1單體的zui大激發(fā)波長為514nm，zui大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的zui大激發(fā)波長為585nm，zui大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。

6、本試劑盒提供了CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200個樣品。

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)操作步驟

1，配制JC-1染色工作液

a、六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mLJC-1染色工作液。

b、取適量JC-1（200×），按照每50µLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

2，陽性對照的設置

把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照11000∶的比例加入到細胞培養(yǎng)液中， 稀釋至10µM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。

3，對于懸浮細胞

a、取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

b、加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

c、在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

d、37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。 （5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。

e、再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4，對于貼壁細胞

注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，應先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。

a、吸除6孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1ml細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

b、加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c、在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d、37℃孵育結(jié)束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。

e、加入2ml細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

f、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5，對于純化的線粒體

a、把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。

b、0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。

c、用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為485nm時，可以在475～520nm范圍內(nèi)設置激發(fā)波長。

d、用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6，熒光觀測和結(jié)果分析

檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設置為525nm，發(fā)射光設置為590nm。

注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在zui大激發(fā)波長和zui大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設置。

出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。 

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項 

1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2，請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。 

4，應避免反復凍融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否則導致JC-1很難充分溶解，嚴重影響后續(xù)的檢測?？梢?0～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.

5，裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。

6，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

 7，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

標簽：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)