1. 蛋白結(jié)構(gòu)

a) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)及疏水氨基酸的相對(duì)數(shù)目對(duì)蛋白質(zhì)的聚集速率和聚集體的穩(wěn)定性有較大的影響。疏水氨基酸會(huì)形成聚集傾向區(qū)域(aggregation-prone region),在特定位置引入一個(gè)新的或不同的疏水氨基酸會(huì)顯著加快蛋白聚集速率。

b) 糖基化對(duì)于許多蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義,如CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化可以穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域及整個(gè)單抗分子。因此去糖基化可能會(huì)干擾單抗的三級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而加速熱誘導(dǎo)聚集。甚至蛋白質(zhì)中糖的結(jié)構(gòu)也會(huì)因?yàn)楦淖兊鞍踪|(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性而對(duì)蛋白質(zhì)的聚集產(chǎn)生影響。

c) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)聚集過程中也會(huì)發(fā)揮一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)凍干誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集與β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān),而與非極性表面積無關(guān)。同時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響巰基-二硫鍵的交換速率,進(jìn)而引起分子間形成二硫鍵而導(dǎo)致聚集。

d) 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的聚集也有一定的影響。盡管聚集傾向區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)聚集有重要的影響,但若它們被適當(dāng)?shù)陌?也依舊會(huì)減小蛋白質(zhì)的聚集。

2. 化學(xué)降解

蛋白質(zhì)會(huì)經(jīng)歷多種化學(xué)降解途徑,盡管許多降解途徑(如氧化、二硫鍵還原、脫氨基等)并不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,然而研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)降解可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性或膠體穩(wěn)定性從而影響蛋白質(zhì)的聚集。如蛋白質(zhì)的氧化會(huì)增加聚集傾向,糖基化可將正的表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)橹行曰蜇?fù)電荷,進(jìn)而增加其疏水區(qū)域的暴露而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集,然而廣泛的糖基化則又會(huì)保護(hù)蛋白減少聚集體的形成。

3. 溫度

溫度通過影響蛋白質(zhì)溶液的性質(zhì)而影響蛋白質(zhì)聚集,其中包括影響蛋白質(zhì)的擴(kuò)散速率、蛋白-蛋白相互作用、蛋白/聚集體溶解性、構(gòu)象穩(wěn)定性及化學(xué)降解等。溫度的升高可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分解折疊的比例的增加、增加蛋白質(zhì)擴(kuò)散和碰撞速率而加速蛋白質(zhì)的聚集。同時(shí),降低溫度也可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊,進(jìn)而也會(huì)增加蛋白質(zhì)的聚集。如核糖體蛋白L9在25oC時(shí)變性程度為36%,而在4oC時(shí)該值達(dá)76%。

4. 溶液條件

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)烈地依賴于溶液條件。其中一個(gè)關(guān)鍵條件是溶液pH,其可以影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和膠體穩(wěn)定性,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的聚集。改變?nèi)芤旱膒H可以改變蛋白-蛋白相互作用的性質(zhì)和程度、蛋白質(zhì)聚集體的溶解性、以及成核和聚集體生長的速率。

另一個(gè)重要的溶液條件是離子強(qiáng)度,離子強(qiáng)度通過影響蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性以及蛋白-蛋白相互作用而影響蛋白質(zhì)的聚集。溶液離子強(qiáng)度的影響通常取決于溶液的pH。

此外,溶液中的陰陽離子可以通過與蛋白分子的特異或非特異性相互作用而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的聚集。在一些情況下,溶液中的陰離子會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的聚集具有更大程度的影響。陰陽離子對(duì)聚集影響的差異可能是由于陰離子與蛋白質(zhì)中陽性集團(tuán)具有較高的結(jié)合傾向。陰離子的影響程度會(huì)在一定程度上受極化程度、蛋白溶液條件的影響。

除此之外,一些輔料或添加劑也常被用于減弱蛋白質(zhì)的聚集。然而,一些*的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑在一定條件下也會(huì)引起蛋白質(zhì)的聚集。如研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在高濃度(> 500 mM)下會(huì)形成分子簇,并會(huì)競爭結(jié)合蛋白質(zhì)表面的水分子,故而會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。表面活性劑如PS由于降解會(huì)形成與蛋白質(zhì)相互作用的不可溶脂肪酸、過氧化物、聚氧乙烯等而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。

5.生產(chǎn)過程

a) 凍融

凍融會(huì)引起許多蛋白質(zhì)的聚集。這是低溫導(dǎo)致的變性/結(jié)構(gòu)擾動(dòng)、冰導(dǎo)致的蛋白吸附/變性、組分的選擇性結(jié)晶等一種或多種因素影響的。凍融的速度也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和聚集傾向。

b) 攪拌

攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集主要?dú)w因于以下一種或多種因素:更多氣液界面的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附/解折疊/聚集、剪切力、暴露于疏水表面(如攪拌棒上)、簡單磨損等。剪切力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集體會(huì)因?yàn)椴煌募羟袟l件而產(chǎn)生不同的形貌。研究表明,搖晃小瓶中凍干的IgG1單抗會(huì)導(dǎo)致亞可見顆粒的增加及長期物理穩(wěn)定性的降低。

c) 泵送(pumping)

在樣品處理過程中使用泵時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的潛在剪切力、加壓/卸壓、蛋白磨損等,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白聚集。盡管研究表明一些蛋白質(zhì)可以容忍一定程度的剪切力,但是剪切力也常常是導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生顆粒、纖維化的原因。此外,泵送過程中的卸壓可能會(huì)產(chǎn)生氣泡,其也會(huì)加劇蛋白質(zhì)的聚集。

d) 光照

光照可在蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)多種光解和非光解的產(chǎn)物,這些降解產(chǎn)物中可能包括具有增強(qiáng)聚集傾向的聚集體或單體。研究表明,在某些情況下,抗體溶液暴露在紫外線或可見光下會(huì)形成高分子量聚集體。

e) 凍干

凍干過程會(huì)移去部分的蛋白質(zhì)水化層,這會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。許多蛋白質(zhì)在傳統(tǒng)的凍干或噴霧干燥過程中會(huì)形成聚集體,但相關(guān)機(jī)理尚未明晰。

f) 其他操作

除此之外,其他操作,如超聲或使用經(jīng)輻射滅菌的注射器也可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。前者會(huì)因?yàn)闅庋ā⒙晧夯蚓植繙囟壬叩葘?dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊和聚集;后者會(huì)因?yàn)檩椛錅缇^程中產(chǎn)生的自由基在蛋白質(zhì)長期存儲(chǔ)過程中會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集體或顆粒的形成。

6. 潛在的污染物

許多來自生產(chǎn)過程或原材料中的潛在污染物也會(huì)影響蛋白質(zhì)的聚集傾向。如生產(chǎn)設(shè)備或原材料中的殘留金屬污染物會(huì)引起一些蛋白質(zhì)和多肽的聚集。殘留的消毒劑,如次氯酸、過氧乙酸可以氧化蛋白質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。