在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護堿基，其原則可參照此處。

雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實wan全沒有必要，一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。

純化問題：純化PCR產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。用的是TAKARA的純化柱試劑盒。酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，30℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λDNAwan全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15 μg的DNA，而一般從1-4 ml菌液提出的 DNA約為3 μg，而PCR純化后的產物（50體系）約為3 μg，所以即便全部加進去，只要純化的 質量好，酶切wan全切得動。

1.  酶切、回收后的PCR產物與載體的連接

摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對于初學者從頭認真計算則 非常有必要。回收的載體片段：回收的PCR產物片段=1：10 ，一般取前者0.03 pmol，后者取0.3 pmol。

pmol為單位的DNA轉換為為μg單位的DNA：（X pmoles×長度bp×650）/ 1,000,000 （注：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為μg,也可以直接用這個公式套.1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg，如載體是5380 bp，則0.03 pmol為

0.03×5.38×0.66=0.106524 μg。

測DNA濃度可以在專用機子上測，注意OD值，一般約1.8-2.0，另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進行估測，如MARKER2000，5微升的 MARKER每個條帶約50 ng。

連接反應：TAKARA的 連接酶上的 說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應體系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16 ℃下反應30分鐘時，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl ，所以wan全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。

2.  轉化

a.  全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受態細胞中，冰中放置30分鐘。

b.  42 ℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。

c.  加入890 μl AMP陰性培養基，37 ℃振蕩培養60分鐘。

取100 μl鋪板。也可離心后余100 μl。

幾個非常重要的問題

1.  做轉化的時候,進行酶連接反應時,注意保持低溫狀態，因為LIGASE酶很容易降解，為保險起見，一般連接3小時，16度。

2.  對含有AMP-RESISTENCE的質粒鋪板時，注意加AMP時的溫度,溫度過高，會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里，烤箱一般溫度為55-60度，然后做的時候拿出來，這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風機吹干。

3.  對照的設立：

為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照：

A 酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線性，如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功。

做轉化時也要進行對照。

設4個：

A.  即拿雙酶切的質粒產物也進行連接反應，這個對照可進一步看雙酶切是否成功，如果長出克隆，說明很有可能只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切成功,當然要保證感受態，培養基、連接酶都'正常'的情況下。

B.  酶切過的未進行連接反應的雙酶切產物,進行轉化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒。

C.  設原始質粒為對照，意為檢測整個操作過程中是否有誤。

D.AMP陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠，檢測感受態狀況。

3.  所有的試劑切記低溫保存

一步一個腳印，不要偷懶，圖省事最后卻更費事，注意設立對照。

經PCR鑒定，克隆90%-100%的陽性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。然后雙酶切鑒定，測序。