實驗原理：過氧化物酶催化以下反應：2 H2O2 →O2+2H2O
這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質類（hemeProteins）。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。
本實驗是以辣根為原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，最后制得高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶分子量在40,000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，等電點7.2；易溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0（對愈創木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內保持穩定，加熱到63℃后15分鐘內穩定。
辣根過氧化物酶氧化還原電勢很低，pH6.08時，E’0= -0.2070V；pH為7.71時，E’0= -0.5787V。
辣根過氧化物酶的作用機理可分以下三步：
第一步，形成綠色有活性的酶一底物復合物Ⅰ：
第二步，復合物Ⅰ轉變成紅色有活性的復合物Ⅱ：復合物Ⅰ+AH→復合物Ⅱ+A
第三步，復合物Ⅱ被還原，釋放出酶：AH：表示還原型氫供體。
在一定程度上復合物Ⅱ可自發地分解成HRP和產物（P），亦可與過量的過氧化氫形成無活性的復合物Ⅲ。復合物Ⅱ自發地分解
辣根過氧化物酶的活力測定方法有多種，主要原理介紹如下：
復合物Ⅱ與過量的過氧化氫形成復合物Ⅲ
1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。Rz值403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質的吸收，結晶的HRP的Rz值為3.04。測定時的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。
2、愈創木酚法：測k4[見反應式⑶]。以愈創木酚（鄰甲氧基酚，guaiacol）為氫給體，其反應如下：
愈創木酚法
四鄰甲氧基連酚有色產物四鄰甲氧基連酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）與底物過氧化氫以及氫供體愈創木酚的濃度有關。方程如下：
生成的速度
e—酶濃度；α0—氫供體起始濃度；x0為過氧化氫的起始濃度。
如果測定的條件選擇成k4α0＞＞k1x0，可以測得k1：
生成的速度
所以：
K1K1—測定過程中底物減少的速度。
本實驗是采用測定k4的方法來判斷酶的純度。
上述測定Rz值和k4值的方法雖然比較簡單，但都不能測得酶的實際活力單位。測定過氧化物酶的傳統方法是連苯三酚試驗法，以過氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形成紅棓酚（Purpurogallin），在430nm處測定產物的形成。用紅棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在標準測定條件下1毫克酶所形成的紅棓酚微克數。
儀器和試劑
儀器：離心機、干燥器、分光光度計。
試劑
⒈. 硫酸銨：工業純和化學純；
⒉. 丙酮。
⒊. 10mM pH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取243.5毫克磷酸2氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫2鈉（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。
⒋. 20mM愈創木酚溶液：取0.22毫升愈創木酚加水至100毫升。
⒌. 40mM過氧化qing溶液：取0.4毫升30%過氧化氫加水至100毫升（如測k1則用10mM過氧化qing溶液）。臨用前配制。
⒍. 5%乙酸鋇溶液
7. 奈氏試劑
⒏. 0.1 mol/Lxiao酸銀溶液
操作步驟
（一）HRP的制備
⒈水提?。?br/>稱取 10斤用水沖刷干凈的鮮辣根（辣根皮中亦含有豐富的HRP），用菜刀切成小碎塊，在攪肉機中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干機（或離心機）甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次，合并兩次濾液，量總體積和度，0。
⒉硫酸銨分級分離：
在不斷攪拌下，每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末（相當于0.40飽和度），大約在1~2小時內加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面渾濁液以3000轉/分離心15分鐘，棄沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末（0.8飽和度）隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以13000轉/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150毫升蒸餾水中（加水量要使沉淀全部溶解為止），分裝于透析袋內，放在流動自來水中進行透析1~2天，直到硫酸銨透析完畢為止（可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查）。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1 mol/Lxiao酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。
將透析液合并，在冰凍離心機中以 4000轉/分離心 15分鐘；去沉淀，量上清液的體積。
⒊丙酮分級分離：
將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4，000/分離心15分鐘，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積（按原上清液體積）-15℃丙酮，（操作同上），靜置后，在冰凍離心機中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。
⒋精制：
將上步酶液適當稀釋，滴加1M硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10-3M，5000轉/分離心10分鐘，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內，對水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冷凍干燥（約得20毫克），產品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產品的Rz值可達3.0左右，置真空干燥器中低溫保存。
（二）HRP的活力測定
⒈活力測定：測定k4值的方法操作如下：
取2個比色池（帶蓋，光程1厘米），加入反應物
酶液
*酶液：將1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后應用。
加好反應物，搖勻，在470nm 讀出OD值，為t=0 的讀數。立即加0.01毫升40mM過yang化氫溶液于2個比色池中，即刻搖勻并記時，每隔30秒鐘讀數一次，約5分鐘。并記下實驗時的室溫。
將所測樣品的OD值減去相應時間對照的OD值，然后以OD值為縱坐標，時間為橫坐標作圖。得一直線，計算出平均每分鐘光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式⑻求出k4值。實際的實驗值k4 = 2.2×10，k4 = 3.1×10，而k4 應當為3.3×10。該方法用于測定粗的無細胞提取液誤差較大。
因為某些物質可干擾四鄰甲氧基連酚的形成?；虿磺髃4值，而把在上述條件下，每分鐘OD470增加0.001所需酶量定為1個HRP活力單位。
⒉蛋白質含量的測定：
將酶液適當稀釋后，用 Folin一酚試劑法比色測定蛋白質含量。
 |
 |
 |
