冰凍切片技術

1.從鋒利的刀片開始

我發現使用新的鋒利的刀片時常常做出高質量的片子。我覺得在醫療場合中某些盡量省錢的做法顯得有些因小失大。一般我對每位患者的標本都使用一組新的刀片，當片子的質量開始下降時，我會立刻更換刀片。某些組織如質地較硬的膠原和鈣化組織會使刀片很快變鈍，因此，經常更換刀片顯得很有必要，有時候我在切片過程中要連續更換2-3次刀片。

2.坐著還是站著

我切片時總是坐在一張凳子上。要學會把刷子作為一種便捷的輔助工具來操作，從而精細地控制顯微厚薄程度的片子。切片時俯身彎腰，頸部過伸的姿勢有些不妥，要盡量處于放松和舒適的姿勢以便能-大程度控制你的左手。

3.刷子

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先學會使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到臺子上。冷凍的片子會自發的卷縮并從刷子上脫離下來，因此，我使用一把有硬毛、夾取面寬的刷子。我發現來自中國的野豬-毛十分堅硬，非常管用。你可以花3美元從工藝店買一把1/4英寸長的#2號扁平無色的刷子，把毛削成一個角度。由于是個有角的頭端，加上握持刷子成一定的角度，這樣刷子與組織接觸時就會象掃帚一樣的平。我不能理解為什么有人使用脆弱的駱駝毛刷子，組織片很容易從這些柔軟的毛上掉下來。

4.握持刷子

左手象拿筆一樣握持刷子，將第五指輕壓于臺面上以穩定握筆的手(或根據手和切片機尺寸的大小置于你感覺合適的地方)，這樣可以保證操作者動作的靈活及可控性。我把刷子削成一個角度，大致與左手握持刷子的角度相同，這樣使刷子平著接觸組織的1/4。

5.搖柄的旋轉

以連續均勻的力量轉動切片機的搖柄，且要毫不猶豫。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開始切片時總要停一下，緩慢的抓取組織，然后再開始轉動搖柄。依我的經驗看來，這種動作增加了起始切片假象的可能，會使片子的厚度不均勻，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時，象前面所說的那樣手握刷子，以一種連續的動作抓取組織，這個動作與刀片接觸組織同時開始并貫穿于整個過程。

6.刷子的移動

組織塊移向刀片時刷子也要同步地向下移動，當組織塊剛好接觸刀片時刷子輕輕停在其底部2mm處并迅速抽離。正是刷子的向下移動使你能連續地抓取組織，當開始的幾毫米組織穿過刀片時便有自發卷曲的現象，這時，運動中的刷子立刻粘住其游離的邊緣部分并水平地拖向切片者。刷子的運動路徑是一個朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，連續不斷。但要注意有時候把組織壓向臺面時會使組織粘在臺面上，可能會導致碎片，應盡量避免。當然預先將組織包埋起來可以使刷子不用接觸到組織，切片也容易多了。

7.貼片

可以從切片機的臺面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一個角度粘住片子的一角，在靜電作用下片子會吸附在玻片上并迅速融化。當然在周圍涂一些包埋物對貼片有利，這種多余的包埋物可以保護片子的邊緣免受皺縮的損壞。有時候碰到貼片困難，我會在切到后2mm包埋物的時候停下來，讓片子留在組織塊上，然后倒轉搖柄，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平，這樣就可以從組織塊面貼片了，這對卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。

8.快速固定

我右手轉動搖柄也同時拿著玻片，片子一切好，立刻粘起片子并將它浸沒于固定液中。固定液需置于方便夠到的地方，我一般將染色架放在染色缸的旁邊，先將片子置于95%的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果組織固定延遲會出現風干的假象，我的經驗是組織片還在切片機的臺面時，風干效應很小，當組織片粘在有溫度的玻片上時就會出現明顯的風干假象，表現為核的細節丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲15秒固定和立刻固定的相同組織的比較，差異非常明顯。

9.切片的厚度

對于一般的手術病理我推薦切6um厚，這種厚度使染色更加飽滿，層次清晰，病理學家通常在2x 和 4x的放大倍數下可以獲得更多的信息。太薄的片子在這種放大倍數下顯得蒼白，容易忽略一些細節。6um的片子可以有更多的時間去避免風干假象，也會減少冰晶所造成的細胞核空洞。當然特殊情況下可能需要更厚或更薄的片子。

10.為什么會掉片

我不能確定組織片粘附到玻片的具體機制，但我相信可能與組織內的液體與玻片發生分子交聯有關。下面我例出幾種染色過程中組織片脫落的情況：

1）本身非常干燥或過度脫水的組織；

2）組織片的周長與面積比過大，象細條形的組織容易受染色缸內液體渦旋應力的影響而脫落，同樣包括薄的纖維囊腫及不規則的壞死組織，太厚的組織也不例外；

3）反藍用的氨水濃度太高；

4）少數情況需要使用100%的乙醇固定；

5）一張玻片貼多個片子時，片子周圍的包埋物相互重疊。