為什么要研究蛋白質(zhì)相互作用？蛋白質(zhì)是細(xì)胞的功能分子，控制了細(xì)胞中所有生物系統(tǒng)。但是，通常它們不是“孤軍奮戰(zhàn)"，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)會與其他的蛋白質(zhì)相互作用，一起參與生命的過程。因此了解未知或已知蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和從細(xì)胞水平上確定細(xì)胞機(jī)制，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要目標(biāo)。
而當(dāng)前研究蛋白質(zhì)相互作用的主要技術(shù)方法，包括免疫共沉淀，熒光共定位，熒光雙分子互補(bǔ)，熒光雙分子互補(bǔ)，熒光能量共振轉(zhuǎn)移等研究方法，通過了解各種研究方法的原理和特點，在實驗中可根據(jù)不同的要求和目的選擇合適的方法。
免疫共沉淀 (co-IP)原理是以抗原和抗體的特異性結(jié)合以及來自細(xì)菌的兩種蛋白—Protein A/G—特異性結(jié)合抗體分子的現(xiàn)象為基礎(chǔ)的研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互作用的有效方法。
人們將抗體和大質(zhì)量的瓊脂糖顆?；蛘叽胖檫M(jìn)行進(jìn)行交聯(lián)或者親和，然后用這個帶有抗體的大顆粒物去識別溶液中的目標(biāo)蛋白，此時如果目標(biāo)蛋白已經(jīng)與其他蛋白相互作用形成復(fù)合體，那么含有目標(biāo)蛋白的蛋白復(fù)合體就會被這些大質(zhì)量的顆粒物所親和，由于抗體錨定在了這些大質(zhì)量的顆粒物上。
人們通過各種緩沖液的清洗除去非特異性的結(jié)合后的顆粒物可以通過離心或者磁力架吸引進(jìn)行收集，此時結(jié)合在這些顆粒物上的蛋白質(zhì)理論上就是可以和目標(biāo)蛋白直接或者間接相互作用的蛋白了。
通常情況下，做實驗前你對于這些可能的互作蛋白已經(jīng)有了猜測，那么可以將大顆粒物拖拽下來的蛋白復(fù)合體跑 SDS-PAGE。
然后用 western-blot 的方法，可以用這些可能的互作蛋白的抗體去進(jìn)行檢測，就能驗證這種蛋白質(zhì)之間的相互作用了。根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌?，免疫共沉淀的方法可以有很多可以修改的地方?br/>
比如，如果你希望驗證蛋白之間直接的相互作用，那么你可以選擇體外翻譯系統(tǒng)，在試管中合成需要驗證互作的一對蛋白，然后混合孵育，并進(jìn)行檢測，也可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)純化這對蛋白，然后進(jìn)行混合孵育并檢測等等。免疫沉淀的方法運用合理，可以玩出很多有意思的實驗，回答很多問題。
熒光共定位，F(xiàn)luorescenceco-localization，在過去，這個技術(shù)一般用于細(xì)胞內(nèi)輔助證明蛋白相互作用，前些年，如果是其他物種的蛋白質(zhì)，你應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證了它們的相互作用，reviewer 可能會說你這個并不能反映原物種中的真實情況，可能是假陽性。
這個時候，一些研究者就將這兩個蛋白分別與不同顏色的熒光蛋白融合表達(dá)于原物種細(xì)胞當(dāng)中，在高分辨顯微鏡下，如果兩種熒光出現(xiàn)在同一位置，那么就證明它們空間上較為接近，很有可能產(chǎn)生了相互作用。然而，就如上一句話里所說的，只是很有可能，并不能作為直接證據(jù)證明它們真的相互作用了。這個技術(shù)一般都是沒辦法時候的辦法，就不舉例子啦。
熒光雙分子互補(bǔ)， bi-molecular fluorescence complementation(BiFC), 人們把綠色熒光蛋白 GFP 分子分割成兩段，分別與接受測試的兩個蛋白融合表達(dá)。如果兩個蛋白相互作用，那么在細(xì)胞中 GFP 的兩個片段就可以在空間上相互接近，并最終能夠在激光的激發(fā)下發(fā)出綠色的熒光。
這里的 GFP 也可以換成螢火蟲熒光素酶 Luciferase，原理相同，不同的是熒光素酶需要有底物的存在，發(fā)出的是自發(fā)熒光而非激發(fā)光 。這類技術(shù)的好處是可以再活細(xì)胞里進(jìn)行觀測，可以進(jìn)行實時監(jiān)控，定量等實驗。
但是該技術(shù)的空間分辨率大概是 250nm，可以說對于蛋白質(zhì)相互作用來說，依然是相當(dāng)遠(yuǎn)的一個距離，因此也有很大可能是假陽性，同時融合蛋白也可能對受試蛋白的空間構(gòu)象造成影響造成假陽性假陰性的結(jié)果?？偟膩碚f，這類技術(shù)還是要優(yōu)于前兩個的。
熒光能量共振轉(zhuǎn)移，fluorescence resonance energy transfer(FRET)，這個技術(shù)與第三條又有所不同。
人們將目標(biāo)蛋白 A 與青色熒光蛋白 CFP 融合表達(dá)，將 A 的可能的互作蛋白 B 與黃色熒光蛋白 YFP 融合表達(dá)，CFP 的激發(fā)光是波長是 414nm 紫外光區(qū)域，而熒光波長是 475nm 藍(lán)光區(qū)域，恰好 YFP 的激發(fā)光是 475nm 附近藍(lán)光區(qū)域，而熒光則是 525nm 附近黃色光區(qū)域。如果 AB 兩蛋白相互作用，空間上相互接近，導(dǎo)致 CFP 和 YFP 分子也在空間上相互接近，那么當(dāng)僅用紫外光激發(fā) CFP 時，CFP 接收能量放出的藍(lán)光將直接被 YFP 吸收，從而發(fā)出黃色的光，如果能夠定量 CFP 的藍(lán)光被轉(zhuǎn)化成為 YFP 的黃光效率的變化，那么就可以檢測出兩個蛋白間的距離的變化 。
因此，這項技術(shù)不僅能驗證蛋白質(zhì)的相互作用，還能夠表征這種相互作用距離的動態(tài)變化，比如蛋白質(zhì)分子直接相對運動的方向速度等。比如在這篇文章里 ，作者們就用 FRET 測定了細(xì)胞運動時的受力情況。
親和純化 - 質(zhì)譜，affinity purification-mass spectrometry(AP-MS)，剛才說了，如果你在實驗之前已經(jīng)對目標(biāo)蛋白有推測的互作蛋白，那么你可以做 western-blot 對它進(jìn)行檢測。
可是，如果你想找一些以前未被報道，你自己也無法猜測的新互作蛋白呢？這個時候，你可以把免疫共沉淀后得到的樣品，送去做蛋白組學(xué)質(zhì)譜的實驗室，通過質(zhì)譜對這個復(fù)合體中的所有成員進(jìn)行鑒定，理論上你就獲得了整個目標(biāo)蛋白復(fù)合體的成員信息。
如果說，之前的實驗都是用一把槍，瞄準(zhǔn)對面山頭的敵人然后各個擊破，那么質(zhì)譜的方法就是拿了一門炮，將對面山頭的敵人一網(wǎng)打盡。AP-MS 的方法還有很多變種。
比如利用一些可以對周圍蛋白進(jìn)行生物su標(biāo)記的酶，我們可以將目標(biāo)蛋白與這些酶融合表達(dá)，那么，在細(xì)胞內(nèi)，這些融合蛋白就可以對目標(biāo)蛋白附近的所有蛋白打上親和素的標(biāo)記，然后通過生物su與親和素*的親和性，我們可以大幅提高 AP-MS 鑒定的靈敏度，在沖洗非特異性結(jié)合的時候，我們就不用擔(dān)心弱相互作用被我們丟失，這類方法叫做鄰近標(biāo)記（proximity labeling）- 質(zhì)譜法。
酵母雙雜交，Yeasttwo hybrid（Y2H）, 這是一個古老的技術(shù)，Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的時候利用大腸桿菌中 GAL4 乳糖操縱子的原理，開發(fā)出這個方法用于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用 。
GAL4 操縱子有兩個結(jié)構(gòu)域，BD（binding domain）結(jié)構(gòu)域和 AD（activation domain），其中 BD 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合在 UAS（upstreamactivating sequence）DNA 區(qū)域，在 AD 結(jié)構(gòu)域可以激活 UAS 下游的基因表達(dá)。
因此，他們把 GAL4 的兩個結(jié)構(gòu)域切分開，這樣，BD 可以與目標(biāo)蛋白結(jié)合，并且先行結(jié)合在報告基因 lacZ 上游的 UAS 區(qū)域，接著，把需要檢驗是否與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白與 AD 結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，如果目標(biāo)蛋白和被檢測蛋白可以相互作用，它們必定會在空間上相互接近彼此，這種相互作用可以使得 AD 和 BD 結(jié)構(gòu)域也在空間上相互接近，這樣就可以激活報告基因 lacZ 的表達(dá)，使得人們可以檢測到 。
這個方法的優(yōu)勢在于廉價且易操作，這個方法一度非常流行，既可以用于篩選目標(biāo)基因的相互作用蛋白，也可以用于驗證相互作用，以及定量檢測相互作用的強(qiáng)度。
但是缺點在于受試蛋白都需要和 AD/BD 結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，空間構(gòu)象可能改變，其次，許多蛋白質(zhì)的相互作用可能同時需要其他蛋白的協(xié)助，而這個系統(tǒng)并無法把這些輔助蛋白也拉進(jìn)來檢測，因此經(jīng)常漏掉很多的蛋白相互作用，第三，由于反應(yīng)發(fā)生在真菌細(xì)胞內(nèi)，如果你的目標(biāo)蛋白來自其他物種，這個實驗可能并不能反應(yīng)蛋白在原物種細(xì)胞里的真實狀態(tài)，最后，有的蛋白質(zhì)可能自身就能夠激活報告基因表達(dá)，比如轉(zhuǎn)錄因子，這樣，這類蛋白就沒辦法通過酵母雙雜交進(jìn)行篩選和驗證相互作用了（當(dāng)然也可以將該蛋白換至 AD 載體上，但是依然有其局限性）。
