一、菌落總數的概念及衛生意義

　　1、菌落總數

　　食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后（如培養基成分、培養溫度和時間、pH、需氧性質等），所得1mL （或1g）檢樣中形成菌落的總數。

　　按國家標準方法規定，即在需氧情況下，37℃培養48h，能在 平板計數 瓊脂平板上生長的細菌菌落總數，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數并不表示實際中的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。

　　2、細菌總數

　　細菌總數指一定數量或面積的食品樣品．經過適當的處理后，在顯微鏡下對細菌進行直接計數。其中包括各種活菌數和尚未消失的死菌數。細菌總數也稱細菌直接顯微鏡數。通常以1g或1mL或1cm2樣品中的細菌總數來表示。

　　3 菌落總數在食品衛生質量評價中的意義

　　1）食品中細菌數量可反映該食品被污染的程度

　　新鮮的食品內部一般是沒有或很少有細菌的，但由于外界污染情況不同，食品被細菌污染的多少就有所不同。食品中細菌數量越多，說明被污染的程度就越嚴重，越不新鮮，對人體健康威脅越大。相反，食品中菌數越少，說明該食品被污染的程度越輕，食品衛生質量越好，對人體健康影響也越小。

　　2）食品中細菌數量可預測食品耐放程度和時間

　　一般講，細菌數越少，食品耐放時間越長；相反，食品耐放時間就越短，例如用O℃保存牛肉，菌落總數為103cfu／cm2時，可保存18天，而當菌落總數增至lO5cfu／cm2時則只能保存7天。另外，用0℃保存魚時，菌落總數為105cfu／cm2時可保存6天．而菌落總數在103cfu／cm2時則可保存12天。

　　3）食品中細菌數量可估測出食品fu敗狀況

　　一般認為日常食品的活菌數為104～107cfu／g。而當活菌數達到108cfu／g則可認為處于初期fu敗階段。例如，活的家禽，皮膚表面的細菌數可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后馬上檢測可達3.5×104cfu／cm2。當菌落數為107cfu/cm2時表示確已經fu敗，雞肉的細菌數達108cfu／cm2時可有氣味并變粘。

　　一般講，食品中細菌數量越多，則會加速fu敗變質過程的進程，甚至可能引起食用者的不良反應。

　　二、菌落總數檢測方法

　　菌落總數的常規檢驗方法菌落總數的常規檢驗方法(GB4789．2-2008)：

　　基本操作一般包括：樣品的稀釋——傾注平皿——培養48（24）小時——計數報告。

　　（一）樣品的處理和稀釋：

　　1．操作方法：

　　1）、以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。

　　固體檢樣在加入稀釋液后，zui/hao置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。

　　2）、用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。

　　3）、另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。

　　2．無菌操作：

　　操作中必須有“無菌操作"的概念，所用玻璃器皿必須是wan全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

　　操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。

　　3．采樣的代表性：

　　如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨，液體樣品須經過振搖，以獲得均勻稀釋液。

　　4．稀釋液：

　　樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。

　　（二）傾注培養

　　1．操作方法：

　　1）、根據標準要求或對污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。

　　2）將涼至46℃平板計數瓊脂培養基注入平皿約15mL，并轉動平皿，混合均勻。同時將平板計數瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。

　　3）待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。

　　4）傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

　　傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察

　　5）為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注zui后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

　　6）溫較低，故多采用30℃）。培養時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養48h后，培養基失重不應超過15％。

　　7）為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培養基混合的平板，不經培養，而于4℃環境中放置，以便計數時作對照觀察。

　　在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養后菌落呈紅色，易于分別。

　　（三）計數和報告

　　1. 操作方法：培養到時間后，計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數，計算出原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數，進行報告。

　　2. 計數：到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

　　3. 稀釋度選擇及菌落數報告方式

　　1）. 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克（或毫升）中菌落總數結果。

　　2）. 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式（l）計算：

　　N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1）

　　式中：

　　N―樣品中菌落數；

　　∑C―平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；

　　n 1―第一個適宜稀釋度接種平板個數

　　n2―第二個適宜稀釋度接種平板個數；

　　d―稀釋因子（第一稀釋度）。

　　3）. 若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300，則對稀釋度zui高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以zui高稀釋倍數計算。

　　4）. 若所有稀釋度的平板菌落數均小于30，則應按稀釋度zui低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

　　5）. 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以zui低稀釋倍數計算。

　　6）. 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30~300之間，其中一部分小于30或大于300時，則以zui接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

　　4. 菌落總數的報告

　　1）. 菌落數在100以內時，按“四舍五人"原則修約，采用兩位有效數字報告。

　　2）. 大于或等于100時，第三位數字采用“四舍五人"原則修約后，取前兩位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入"原則修約后，采用兩位有效數字。

　　3）. 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。

　　4）. 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。

　　5）. 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告。

　　（四）特別注意

　　1 不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現逆反現象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數報告的依據。

　　2．當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。

　　3．當計數平板內的菌落數過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。